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細(xì)胞凋亡試劑盒的常見誤區(qū)

更新時間:2025-06-19  |  點(diǎn)擊率:64
  細(xì)胞凋亡試劑盒,特別是TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒,在使用過程中存在一些常見誤區(qū)。以下是對這些誤區(qū)的詳細(xì)分析:
  一、樣本處理不當(dāng)
  1.固定不充分或固定液選擇不當(dāng)
  -誤區(qū):未使用推薦的固定液(如4%多聚甲醛)進(jìn)行固定,或固定時間不足。
  -分析:固定不充分會導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,影響后續(xù)標(biāo)記效率。乙醇等固定液對組織的滲透力較弱,不推薦使用。
  2.切片過厚
  -誤區(qū):樣本切片過厚,導(dǎo)致標(biāo)記染色不充分。
  -分析:切片過厚會增加標(biāo)記染色的難度,降低檢測靈敏度。應(yīng)使用適當(dāng)?shù)那衅穸?,以便?biāo)記染色充分。
  3.脫蠟/水化不充分
  -誤區(qū):對于石蠟切片,脫蠟/水化步驟不充分。
  -分析:脫蠟/水化不充分會導(dǎo)致染料無法充分滲透到樣本中,影響檢測結(jié)果。應(yīng)確保脫蠟/水化步驟充分進(jìn)行。
  二、標(biāo)記染色操作不當(dāng)
  1.標(biāo)記染色時間過短
  -誤區(qū):標(biāo)記染色時間過短,未達(dá)到推薦的孵育時間。
  -分析:標(biāo)記染色時間過短會導(dǎo)致標(biāo)記不充分,熒光信號弱或無信號。應(yīng)確保標(biāo)記染色時間達(dá)到推薦的孵育時間。
  2.TdT酶或熒光素/酶標(biāo)記的dUTP濃度過低
  -誤區(qū):未按照說明書推薦的比例配制標(biāo)記工作液,導(dǎo)致濃度過低。
  -分析:濃度過低會降低標(biāo)記效率,影響檢測結(jié)果。應(yīng)嚴(yán)格按照說明書推薦的比例配制標(biāo)記工作液。
  3.TdT酶失活
  -誤區(qū):標(biāo)記工作液配制后長時間保存,導(dǎo)致TdT酶失活。
  -分析:TdT酶失活會導(dǎo)致標(biāo)記無法進(jìn)行,熒光信號弱或無信號。標(biāo)記工作液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用,不宜長期保存。
 

 

  三、非特異性染色與假陽性
  1.固定液濃度過高或作用時間過長
  -誤區(qū):使用高濃度固定液或固定時間過長,導(dǎo)致DNA鏈不規(guī)則斷裂。
  -分析:高濃度固定液或固定時間過長會導(dǎo)致細(xì)胞自溶、DNA鏈不規(guī)則斷裂,產(chǎn)生假陽性。應(yīng)使用適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ簼舛群凸潭〞r間。
  2.蛋白酶K處理不當(dāng)
  -誤區(qū):蛋白酶K處理時間過長或濃度過大,破壞核酸結(jié)構(gòu)。
  -分析:蛋白酶K處理不當(dāng)會導(dǎo)致核酸結(jié)構(gòu)破壞,出現(xiàn)假陽性。應(yīng)適當(dāng)調(diào)整蛋白酶K的處理時間和濃度。
  3.樣本中酶活性水平較高
  -誤區(qū):未對酶活性水平較高的樣本進(jìn)行充分固定。
  -分析:如平滑肌細(xì)胞或組織中DNA酶或DNA聚合酶的活性水平較高,易發(fā)生非特異性的熒光標(biāo)記。取得這些細(xì)胞或組織后需立即充分固定。
  四、熒光檢測操作不當(dāng)
  1.曝光時間過長
  -誤區(qū):熒光拍照時曝光時間過長,導(dǎo)致背景熒光過強(qiáng)。
  -分析:曝光時間過長會導(dǎo)致背景熒光過強(qiáng),掩蓋真實(shí)信號。應(yīng)調(diào)整曝光條件,先對陰性組調(diào)整到無背景光,再用這個曝光條件去拍攝實(shí)驗組。
  2.未避光操作
  -誤區(qū):標(biāo)記與檢測樣本時未避光操作。
  -分析:熒光易淬滅,未避光操作會導(dǎo)致熒光信號減弱。應(yīng)在避光條件下進(jìn)行標(biāo)記與檢測樣本的操作。
  細(xì)胞凋亡試劑盒在使用過程中需要特別注意樣本處理、標(biāo)記染色操作、非特異性染色與假陽性以及熒光檢測操作等方面的問題。遵循說明書推薦的操作步驟和注意事項,可以有效避免這些誤區(qū),提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
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