常用熒光素標記蛋白質(zhì)的方法有攪拌法和透析法兩種。以FITC（異硫氰酸熒光素）標記為例，攪拌標記法為：先將待標記的蛋白質(zhì)溶液用0.5ml/L pH9.0的碳酸鹽緩沖液平衡，隨后在磁力攪拌下逐滴加入FITC溶液，在室溫持續(xù)攪拌4～6h后，離心，上清即為標記物。此法適用于標記體積較大，蛋白含量較高的抗體溶液。優(yōu)點是標記時間短，熒光素用量少。但本法的影響因素多，若操作不當會引起較強的非特異性熒光染色。

　　透析法適用于標記樣品量少，蛋白含量低的抗體溶液。此法標記比較均勻，非特異染色也較低。方法為：先將待標記的蛋白質(zhì)溶液裝入透析袋中，置于含F(xiàn)ITC （異硫氰酸熒光素）的0.01mol/L pH9.4碳酸鹽緩沖液中反應過夜，以后再對PBS透析法去除游離色素。低速離心，取上清。

　　熒光素標記完成后，還應對標記抗體進一步純化以去除未結合的游離熒光素和過多結合熒光素的抗體。純化方法可采用透析法或?qū)游龇蛛x法。

　　用于熒光素標記的抗體，要求是高特異性和高親和力的。所用抗血清中不應含有針對標本中正常組織的抗體。一般需經(jīng)純化提取IgG后再作標記。作為標記的熒光素應符合以下要求：

　?、賾哂心芘c蛋白質(zhì)分子形成共價鍵的化學基團，與蛋白質(zhì)結合后不易解離，而未結合的色素及其降解產(chǎn)物易于清除。

　?、跓晒庑矢撸c蛋白質(zhì)結合后，仍能保持較高的熒光效率。

　　③熒光色澤與背景組織的色澤對比鮮明。

　?、芘c蛋白質(zhì)結合后不影響蛋白質(zhì)原有的生化與免疫性質(zhì)。

　?、輼擞浄椒ê唵?、安全無毒。

　　⑥與蛋白質(zhì)的結合物穩(wěn)定，易于保存。