用于熒光素標記的抗體，要求是高特異性和高親和力的。所用抗血清中不應(yīng)含有針對標本中正常組織的抗體。一般需經(jīng)純化提取IgG后再作標記。作為標記的熒光素應(yīng)符合以下要求：

　?、賾?yīng)具有能與蛋白質(zhì)分子形成共價鍵的化學基團，與蛋白質(zhì)結(jié)合后不易解離，而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物易于清除。

　?、跓晒庑矢?，與蛋白質(zhì)結(jié)合后，仍能保持較高的熒光效率。

　　③熒光色澤與背景組織的色澤對比鮮明。

　?、芘c蛋白質(zhì)結(jié)合后不影響蛋白質(zhì)原有的生化與免疫性質(zhì)。

　?、輼擞浄椒ê唵?、安全無毒。

　?、夼c蛋白質(zhì)的結(jié)合物穩(wěn)定，易于保存。

　　常用熒光素標記蛋白質(zhì)的方法有攪拌法和透析法兩種。以FITC（異硫氰酸熒光素）標記為例，攪拌標記法為：先將待標記的蛋白質(zhì)溶液用0.5ml/L pH9.0的碳酸鹽緩沖液平衡，隨后在磁力攪拌下逐滴加入FITC溶液，在室溫持續(xù)攪拌4～6h后，離心，上清即為標記物。此法適用于標記體積較大，蛋白含量較高的抗體溶液。優(yōu)點是標記時間短，熒光素用量少。但本法的影響因素多，若操作不當會引起較強的非特異性熒光染色。

　　透析法適用于標記樣品量少，蛋白含量低的抗體溶液。此法標記比較均勻，非特異染色也較低。方法為：先將待標記的蛋白質(zhì)溶液裝入透析袋中，置于含F(xiàn)ITC （異硫氰酸熒光素）的0.01mol/L pH9.4碳酸鹽緩沖液中反應(yīng)過夜，以后再對PBS透析法去除游離色素。低速離心，取上清。

　　熒光素標記完成后，還應(yīng)對標記抗體進一步純化以去除未結(jié)合的游離熒光素和過多結(jié)合熒光素的抗體。純化方法可采用透析法或?qū)游龇蛛x法。